恩諾沙星(ENR)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒

使用目的：

本試劑盒用于飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中中恩諾沙星(ENR)殘留的定量檢測。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競爭ELISA方法，在微孔板包被有恩諾沙星(ENR)偶聯(lián)抗原，加入恩諾沙星(ENR)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離恩諾沙星(ENR)與微孔條上預(yù)包被的恩諾沙星(ENR)偶聯(lián)抗原互相競爭抗恩諾沙星(ENR)抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中恩諾沙星(ENR)含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中恩諾沙星(ENR)的含量。

一、試劑盒組成

1. 預(yù)包被的恩諾沙星(ENR)偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。

2. 恩諾沙星(ENR)標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0ng/ml, 1ng/ml，3ng/ml ,9ng/ml ppb,27ng/ml,81ng/ml。

3. 抗恩諾沙星(ENR)）抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。

3. 顯色液A：1瓶（6ml）。

4. 顯色液B：1瓶（6ml）。

5. 終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。

6. 樣本稀釋液：1瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。

7. 濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。

8. 說明書一份。

二、需要而未提供的材料

1. 設(shè)備

2. 波長450nm酶標(biāo)儀。

3. 粉碎機(jī)。

4. 量筒。

5. 振蕩器。

6. 漏斗。

7. Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。

8. 微量移液器。

9. 試劑

10. 去離子水或蒸餾水。

11. 甲醇。

12. 貯存

13. 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

14. 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

三、注意事項(xiàng)

1. 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。

2. 不要使用過期試劑盒。

3. 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品中含有恩諾沙星(ENR)，使用時應(yīng)特別注意，操作時應(yīng)戴手套。

5. 終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6. 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用洗頭不能混用，否則會影響試驗(yàn)結(jié)果。

7. 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用洗頭不得混用，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

8. 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9. 混合試劑時應(yīng)避免起泡。

四、工作液準(zhǔn)備

1. 恩諾沙星(ENR)）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml, 1ng/ml，3ng/ml ,9ng/ml ppb,27ng/ml,81ng/ml

2. 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

3. 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

4. 顯色劑：已備用，避免光線直照

5. 反應(yīng)終止液：已備用

五、樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

1. 取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

2. 強(qiáng)力振蕩3分鐘

3. 用Whatman No 1濾紙過濾

4. 取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

六、酶免分析步驟

1. 實(shí)驗(yàn)須知

2. 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時間約2小時。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。

3. 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

4. 請不要改變分析程序

5. 請使用精確的微量移液器

6. 操作一旦開始，請不要中斷任何程序

7. ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度地取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作

8. 為避免交叉污染，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9. 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

七、分析步驟

1. 預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測

2. 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

3. 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

4. 在B0孔中加入50μl 0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液

5. 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

6. 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

7. 在所有孔中加入50μl的抗恩諾沙星(ENR)抗體酶結(jié)合物

8. 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。

9. 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

10. 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。

11. 反應(yīng)

12. 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之徹底混勻

13. 37℃溫浴10min

14. 每孔中加入50μl終止液，混勻

15. 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。

八、結(jié)果計(jì)算

1. 定量分析

2. 所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

3. 以恩諾沙星(ENR)濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為恩諾沙星(ENR)濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中恩諾沙星(ENR)濃度C（ng/ml）

4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

5. 半定量測定

6. 目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

7. 儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

九、特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)

恩諾沙星(ENR) 100%

十、試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.05 ng/ml

B0吸光度最佳值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。

試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ng/ml~100ng/ml。

十一、分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。